Aprótínín CAS 9087-70-1

Aprótínín78R2S7, sameindaformúla C284H432N84O, CAS 9087-70-1, Það er próteasahemill sem getur hamlað trypsín og chymotrypsin, komið í veg fyrir virkjun annarra virkra próteasóma í brisi og sjálfvirkjun trypsínógens. Klínískt notað til að koma í veg fyrir og meðhöndla bráða brisbólgu, blæðingu af völdum fibrinolysis og dreifð blóðstorknun í æð. Það er einnig hægt að nota til meðferðar gegn losti. Próteasahemlar eru efni sem geta bundist ensímum og dregið úr hraða niðurbrots hvarfefnis. Próteasahemlar með próteineiginleika eru víða til staðar og tvær tegundir próteasahemla með próteineiginleika hafa verið einangraðar úr sojabaunum: Kuniz trypsín hemill og Baumann Bellck hemill. Sá fyrrnefndi hefur mólmassa 20-25 ku en sá síðarnefndi hefur mólmassa 8 ku.

Raðbrigðaaprótínín(RTI16) getur hamlað kininasa og trypsíni og er náttúrulegur ó-sérhæfður serínpróteasahemill. Það er einkeðju grunnprótein sem samanstendur af 58 amínósýruleifum, með 3 tvísúlfíðtengi krosstengd í keðjunni. Í langan tíma hefur aprotinn verið notað til meðferðar á bráðri brisbólgu. Eftir tíunda áratuginn var farið að nota raðbrigða aprotinn í hjarta- og brjóstholsaðgerðum til að vernda blóðflögur, draga úr blæðingum og útflæði og til klínískrar meðferðar á sjúklingum með storkusjúkdóma. Því hefur markaðsstærð aprótins stækkað hratt og orðið eitt af mikilvægu lífefnafræðilegu lyfjunum.

Myndun

 

Sem stendur eru raðbrigða aprótínblöndur sem fást í verslun aðallega útdrættir úr líffærum eins og lungum úr nautgripum, sem hafa flókna ferla og mikinn kostnað. Því er mjög mikilvægt að kanna framleiðslu á raðbrigða aprótíni með erfðatækni.

Þegar notað er seytingarkerfi er framleiðsla aprótíns almennt lítil og virkni vörunnar sem myndast er einnig lítil. Með samrunatjáningu er búist við að það auki tjáningarstig raðbrigða aprótins til muna.

 

Raðbrigða aprótín tjáningarplasmíð pGrxA BPTI var smíðað í þessum tilgangi og auðkenningarstaður fyrir FXa var hannaður á milli samrunaaðilans og raðbrigða aprótínsins. Eftir að hafa verið tjáð í formi inntökuhluta var samrunafélaginn hreinsaður og brotinn aftur saman með hlaupsíun. Samrunafélaginn var skorinn út af FXa til að fá prótein með sömu virkni og náttúruvaran. Með hagræðingu tjáningarskilyrða var afraksturinn verulega bættur miðað við fyrri tjáningarkerfi.

Hagræðing á tjáningu verkfræðilegra baktería:

 

Sáð glýserólrörbakteríur á LB/AMP agarplötur, ræktaðu við 37 gráður í 20 klukkustundir, skafðu nýlendurnar og sáðu þær í 5 ml af LB/AMP fljótandi miðli við 37 gráður, 200 sn./mín., og ræktaðu yfir nótt. Sáð 5% af sáðefninu í 100 ml af maísuppleysu, ræktað við 37 gráður og 220 sn./mín á hristara, framkallað í 7 klukkustundir og síðan skilvindu (8000 sn./mín., 5 mín, 4 gráður) til að safna bakteríufrumunum. Vigðu blautþyngd bakteríufrumnanna og greindu tjáningu þeirra með 15% SDS-PAGE.

Ræktun gerjunartanks

 

Ræktun gerjunartanks:

Með því að nota þýskan Biostat 30 L gerjunartank, við 37 gráður, með uppleystu súrefni stjórnað við 20%, pH 7,0. Með því að nota gerjunartank til að tjá samrunapróteinið, fengust 260 g af blautum bakteríufrumum úr 16 L af gerjunarsoði, um það bil 16 g/L; Tjáningarstigið er um 45%,

Veggbrot og innlimun í líkama bakteríufrumna:

 

Eftir að ræktun er lokið skaltu safna bakteríufrumunum, bæta 1 g af bakteríufrumum við 10 ml af lausn A (50 mmól/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmól/L EDTA), stöðva þær vandlega, hljóðhljóða frumurnar í ísbaði, vinna í 30 sekúndur, 40 sekúndur, 40 sekúndur, 40 sekúndur, 30 sekúndur. hringrásir. Flytið vökvann yfir í skilvindurör, skilið við 4 gráður og 8000 sn/mín í 15 mínútur og botnfallið er óhreinsað innihaldsefni.

Undirbúningur upplausnarlausnar fyrir innihaldsefni:

 

Þvoið óhreinsaða innilokunarhlutann með lausn B (50 mmól/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmól/L EDTA, 1% Triton-X100) tvisvar, í hvert sinn í 0,5 klukkustundir, skilið í skilvindu til að fjarlægja ofanvatnið og fáið tiltölulega hreina innilokunarhluta. Bætið 1 g af innihaldsefnum út í 5 mL af lausn C (50 mmól/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mól/L þvagefni, 1 mmól/L EDTA, 5 mmól/L DTT), ræktið yfir nótt við 4 gráður, hreinsið og leysið upp, skilið í skilvindu við 12000 r/min og náið til að safna 1 r/min. líkamsupplausn. Fáðu raðbrigða aprotinn.

Lyfjafræðileg áhrif:

 

 

Aprótínínhindrar trypsín úr mönnum, fibrinolytic ensím, plasma og angíótensín í vefjum með afturkræfum ensímhemla fléttum sem myndast í ákveðnu efnahlutfalli. Próteasar með serínvirkni gegna stóru hlutverki í vasopressin kininogen kinin kerfinu, complement kerfinu og storkukerfinu, þar sem plasmín og plasma vasopressin gegna mikilvægu hlutverki.

 

Aprótinn hefur hamlandi áhrif með því að mynda aprotinn próteasa flókið í gegnum serín virka hlutann á ensíminu. Hins vegar, þegar það er sameinað mismunandi próteasum, sýnir það mismunandi sundrunarfasta. Bindingin við trypsín er sterkust (Ki=0.06nmoN), sem er einn af lægstu föstunum sem greint er frá í prótein-próteinvíxlverkunum (Laydunski o.fl.. 1974). Bindingin við fibrinolytic ensím manna er ekki mjög sterk. Vegna mikils K-gildis ensímhemla fléttunnar (Ki=1 nmoN) getur það verið afturkræft (Wimann, 1980), og flókið sem binst angíótensíni í plasma úr mönnum er frekar veikt (Ki=30 nmól/l), en samt innan lækningasviðs aprótíns (Nakahara, 1983).

 

Aprotinn binst ekki aðeins lausum ensímsameindum heldur einnig ensímum sem þegar hafa bundist þriðja efnisþáttinum (ef virka miðja ensímsins hefur enn bindingargetu). Þess vegna hamlar aprotinn frjáls fíbrínólýsandi ensím og getur einnig hindrað millistigs fíbrínólýsín keðju kínasa flókið sem myndast við segaleysandi meðferð með keðju kínasa (Wimann, 1980).
Fíbrínleysandi áhrif aprótíns byggjast á hömlun á plasmíni sem virkjast með vatnsrofi próteina. Ólíkt tilbúnum andfíbrínlýsandi leysiefnum, vegna beinnar hömlunar á ofvirkjuð plasmíni, verndar aprótín ekki aðeins beina hvarfefnið (fíbrín) gegn niðurbroti af völdum plasmíns, heldur verndar það einnig fíbrínógen, þætti V og VIII í plasma og alfa 2-glóbúlín í sermi.

 

Í tilraunum á losti af völdum endotoxíns og ofnæmislosi getur Trasylol hamlað verulega virkjun kínínógens. (Massion et a1．1972).
Trasylol getur komið í veg fyrir eða seinkað þróun millivefsbjúgs í lungum (lostlunga). Hamlandi áhrif þess eru skammtaháð-og tíma-háð (Lorthioir o.fl., 1973).
Við lost getur blóðþurrð í brisi framleitt mjög eitrað peptíðefni, þ.e. myocardial inhibitory factor (MDF). Þessi þáttur er nátengdur dauða vegna losts.

 

MDF er hægt að greina í blóðvökva músa, hunda, öpa og manna með blæðingarlost, rotþró, hjartalost og brunalost. MDF getur valdið lækkun á samdrætti hjartavöðva í öllum tilfellum blæðinga og á sama tíma veldur það samdrætti í innyflum, sem leiðir til staðbundinnar blóðþurrðar og framleiðslu á meira MDF. Þar að auki, vegna eitrunarskemmda af völdum netþekjukerfisins, seinkar úthreinsun þess í blóðrásinni. Trasylol getur mjög komið í veg fyrir framleiðslu á MDF (Lefer 1984).

Aprótínín, sem lítil sameind efnasamband sem þolir fibrinolysis, sýnir verulega og sérstaka ensímhamlandi eiginleika. Það hindrar ekki aðeins virkni trypsíns á áhrifaríkan hátt, heldur hefur það einnig áhrif á önnur skyld próteinleysandi ensím og gegnir því mikilvægu hlutverki í frumulíffræðitilraunum. Sérstaklega við frumu- og vefjagreiningu og einsleitun getur Aproinn þjónað sem skilvirkur próteasahemill, sem kemur í veg fyrir slysni niðurbrot markpróteina, sem er mikilvægt til að viðhalda heilleika og nákvæmni sýna.

Hindrandi áhrif Aprotins sýna skýra skammtaháð, það er að segja að eftir því sem styrkur þess eykst eykst hamlandi áhrif á fibrinolytic virkni að sama skapi. Þessi eiginleiki gerir vísindamönnum kleift að stjórna tilraunaaðstæðum með nákvæmari hætti til að fá áreiðanlegri og endurgeranlegri tilraunaniðurstöður. Á sama tíma getur Aprotin einnig lengt storknunartíma blóðs, sem staðfestir enn frekar mikilvægan þátt þess í storknunarferlinu. In vitro tilraunir hafa sýnt að Aprotin er áhrifaríkur innræn storkuhemill sem getur truflað og stjórnað lykilferlum í storknunarferlinu.

Aprotini hefur einnig sýnt fram á einstök lyfjafræðileg áhrif. Það getur verulega hamlað ferli blóðtappaupplausnar in vitro, lengt blæðingartíma halaklippingar hjá rottum og lengt storkutíma í plasma manna. Þessar niðurstöður benda til þess að Aprotinn geti haft hugsanlega blæðingar- og segaeyðandi áhrif. Til að sannreyna frekar áhrif þess in vivo, gerðu vísindamenn tilraunir með skammhlaupslíkani með slagæðabláæðum hjá rottum. Niðurstöðurnar sýndu að Aprotnin getur dregið verulega úr þyngd blóðtappa, sem styður enn frekar möguleika þess sem segalyf.

Í stuttu máli hefur Aprotnin, sem lítið sameindasamband sem hamlar fíbrínlýsu, sýnt fram á verulegan ensímhamlandi eiginleika og lyfjafræðileg áhrif bæði in vitro og in vivo. Notkun þess í frumulíffræðitilraunum veitir vísindamönnum öflug tæki, en niðurstöður þess í in vivo rannsóknum gefa mikilvægar vísbendingar og grundvöll fyrir þróun þess sem blæðingar- og segavarnalyf. Í framtíðinni, með frekari rannsóknum á verkunarmáta Aprotnins og klínískum rannsóknum, er búist við að við sjáum víðtækari notkun þess á læknisfræðilegu sviði.

maq per Qat: aprotinin cas 9087-70-1, birgja, framleiðendur, verksmiðja, heildsölu, kaupa, verð, magn, til sölu