GLP-1(tengill:https://www.Bloomtechz.com/synthetic-chemical/Peptid/GLPp-1-PIDE-Cas-87805-34-3}.html) er fjölpeptíð hormón sem samanstendur af 30 amínósýrum. Með ítarlegum rannsóknum á GLP-1 hafa fleiri og fleiri tilbúnar aðferðir verið þróaðar. Þessi grein mun kerfisbundið kynna þær nú þekktu nýmyndunaraðferðir GLP-1.
Aðferð 1, nýmyndun í fastfasa:
Fastfasa nýmyndun er mikið notuð aðferð við peptíð- og próteinmyndun og er einnig almennt notuð við nýmyndun GLP-1. Í fastfasa nýmyndun er kjarnabyggingin mynduð með því að tengja fyrstu amínósýruna við plastefnið. Næst er næstu amínósýru bætt við í röð og efnafræðilega hvarfað með viðeigandi þéttiefni. Að lokum er hægt að fá markafurðina með því að kljúfa fjölpeptíðið úr plastefninu.
Mikilvægi fastfasa nýmyndunar er að það gerir sjálfvirkni og stórfellda framleiðslu peptíðmyndunar kleift. Núverandi almennar fastfasa nýmyndunaraðferðir innihalda Fmoc og Boc. Meðal þeirra notar Fmoc aðferðin N-Fmoc verndarhópinn til að vernda peptíðið, en Boc aðferðin notar tert-bútýloxýkarbónýl til að vernda karboxýlhópinn.
Aðferð tvö, fljótandi fasa nýmyndun:
Vökvafasa nýmyndun er hefðbundin aðferð við peptíð nýmyndun þar sem hvarfefnin eru sett í vökvafasann fyrir hvarfið. Kosturinn við vökvafasa nýmyndun er að hvarfskilyrðin eru væg og hentug til að breyta viðkvæmum efnafræðilegum byggingum. Hins vegar, vegna of margra hvarfefna, er hreinsunarferlið tiltölulega fyrirferðarmikið. Efnahvörf í vökvafasa myndun fela í sér:
1. Þéttingsviðbrögð:
Þéttingsviðbrögð eru eitt af grunnhvarfunum í peptíðmyndun, það er að segja að karboxýlhópurinn sem byrjað er af þéttingarefnum eins og DCC og HOBt er tengdur amínóhópi amínósýru með asýlerunarviðbrögðum. Hvarfaðstæður eru vægar og uppskeran er mikil.
2. Brotthvarfsviðbrögð:
Brotthvarfið er að minnka metíónínið í dítíólið með NaBH4 og öðrum afoxunarefnum, sem gerir það óvirkt. Hvarfið þarf að fara fram við grunnskilyrði.
3. Fjarlæging verndarhópa:
Vegna mismunandi virkni amínósýra í peptíðkeðjunni verða mismunandi verndarhópar notaðir til verndar. Eftir að myndun er lokið þarf að fjarlægja verndarhópinn. Fyrir Fmoc aðferðina er piperidin venjulega notað til að fjarlægja Fmoc; en fyrir Boc aðferðina er TFA notað til að fjarlægja Boc.
Aðferð þrjú, efnasmíði:
GLP-1 er fjölpeptíðhormón með mikilvæga líffræðilega virkni. Hægt er að framkvæma myndun þess með ýmsum aðferðum, þar á meðal er efnasmíði ein algengasta aðferðin. Kosturinn við efnasmíði er að hún getur framleitt mjög hreinar markvörur, sem henta fyrir stórframleiðslu. Kemísk nýmyndunaraðferð og ítarleg skref GLP-1 verða kynnt hér að neðan.
1. Tilbúin leið og val á verndarhópi:
GLP-1 sameindin samanstendur af 36 amínósýrum, þar á meðal 21 L-gerð og 15 D-gerð amínósýrum. Áður en nýmyndunin er framkvæmd er nauðsynlegt að velja viðeigandi tilbúið leið og velja samsvarandi verndarhóp í samræmi við tilbúið skilyrði. Fmoc solid-fasa nýmyndun er venjulega notuð fyrir sjálfvirka stórfellda nýmyndun. Þessi aðferð notar N-9-flúoróimídó karboxýlvörn (N-Fmoc) sem verndarhóp og þarf einnig að velja viðeigandi aukaverndarhóp (eins og tert-bútýl eða metýl) til að tryggja vernd tiltekinna staða. Í hvert sinn sem nýrri amínósýru er bætt við þarf fyrst að fjarlægja Fmoc verndarhópinn og síðan er varið tengiefni næstu amínósýru bætt við.
2. Nýmyndun kjarna amínósýruröðarinnar:
Kjarnaröð GLP-1 samanstendur af 21 amínósýrum, þar á meðal lykilseríni og fjórum prólýl-glútamínsýru tvípeptíðröðum. Í fastfasa myndun er hægt að skipta myndun kjarnaröðarinnar í eftirfarandi skref:
2.1. Bætið ediksýrukarbamati (Fmoc-NH-CH2CO2Et) og 2-Cl-Trt-Cl við fastfasa gerviplastefni og framkvæmið þéttingarhvarf með DIC/NMM tengiefni.
2.2. Fjarlægðu Fmoc verndarhópinn með því að afvernda hópviðbrögðum.
2.3. Bættu við næstu amínósýru, endurtaktu skref 1 og skref 2 í röð þar til kjarnaröðin er mynduð.
2.4. Myndun pentapeptíðbygginga á fastfasa plastefni. Bætið asetalization hvarfefninu við fastfasa plastefnið, hvarfið við N-enda auðkenningarmiðilinn (eins og HBTU), bætið hliðarkeðjuvarnarhópnum af seríni sem hjálparafoxunarefni og fjarlægðu síðan Fmoc verndarhópinn.
2.5. Undir hvata Bacillus subtilis transferasa (ProTide) fer pentapeptíðbyggingin í skiptum við forvera serínjoðasetats.
3. Nýmyndun amínósýruröðarinnar sem eftir er:
Eftir að myndun kjarnaröðarinnar er lokið er nauðsynlegt að halda áfram að bæta við amínósýrunum sem eftir eru, þar á meðal amínósýrur af L- og D-gerð. Viðbót þessara amínósýra þarf að byrja á kjarnaröðinni, bæta við næstu amínósýru í röðinni og nota samsvarandi þéttiefni til að framkvæma efnahvörf þar til heildar GLP-1 fjölpeptíð sameind er mynduð. Meðan á þessu ferli stendur er einnig nauðsynlegt að velja viðeigandi verndarhóp eftir þörfum, og framkvæma skrefin viðbrögð, fjarlægja verndarhóp og bæta amínósýru í röð.
4. Natríumhýdroxíð meðferð:
Eftir að öllum amínósýrunum hefur verið bætt við myndast ófullkomin peptíðkeðja á fastfasa plastefninu og þarf að vinna hana til að mynda fullmótaða peptíðsameind. Í fyrsta lagi ætti ómyndað peptíð að vera vatnsrofið með natríumhýdroxíði, þannig að C-enda karboxýlhópurinn sem upphaflega var tengdur við plastefnið losnar frá plastefninu og verndarhópurinn losnar í vatni. Eftir vatnsrofsviðbrögð er markafurðin fengin.
5. Úrkoma og þvottur:
Eftir meðhöndlunina er vatnsrofna lausnin meðhöndluð með sýru til að fella út markafurðina. Því næst var kögglan blandaður aftur í vatni, fylgt eftir með miklum þvotti til að fjarlægja óhreinindi.
6. Hreinsun:
Lokaskrefið er hreinsun á viðkomandi vöru, venjulega með hágæða vökvaskiljun. Í þessu ferli er hægt að ákvarða hreinleika vörunnar með því að greina hámark lausnarinnar í massarófinu. Í stuttu máli, efnafræðileg nýmyndun GLP-1 krefst margra lota af flóknum viðbrögðum og ströngum hreinsunarferlum til að loksins fá virku markafurðina.
Aðferð fjögur, lífmyndun:
GLP-1 er mikilvægt fjölpeptíðhormón með ýmis lífeðlisfræðileg áhrif, þar á meðal að stuðla að insúlínseytingu, bæla matarlyst, draga úr líkamsþyngd og viðhalda insúlínnæmi o.s.frv. Lífmyndunaraðferð GLP-1 er aðallega framleidd af L frumum í briskirtlinum og myndun hans er stjórnað með fæðuinntöku. Nákvæm skref eru kynnt sem hér segir:
1. Undirbúningsvinna fyrir myndun:
Áður en lífmyndun GLP-1 fer fram þarf að vinna nokkra undirbúningsvinnu, þar á meðal að ákvarða frumugerðina sem notuð er, stilla ræktunarskilyrði og velja viðeigandi hvarfaensím. L frumur eru aðal uppspretta GLP-1 nýmyndunar vegna þess að þær innihalda undanfara tveggja hormóna, GIP (glúkagonlíkt peptíð 1) og GLP-1. Hægt er að einangra L frumur úr þekjuþekju í þörmum kanína eða músa. Fyrir lífmyndun þarf að rækta frumur í nægilegan fjölda og nægjanleg næringarefni og viðeigandi ræktunarskilyrði ættu að vera til staðar. Að auki er nauðsynlegt að velja viðeigandi hvarfaensím til að stuðla að hvarfinu.
2. Myndun og úrvinnsla forefna:
Lífmyndun GLP-1 fer aðallega fram í L frumum og forveri þess er samsettur úr tveimur hormónum, GIP og GLP-1. Eftir að hafa farið inn í innkirtlafrumur eru GIP og GLP-1 unnin með próteinleysandi ensímum og klofnar í einstök peptíð. Röð ensíma og samþátta taka þátt í þessu ferli, þar á meðal forvera fjölpeptíðsýruasa (PC2), ísómerasa og síðviðloðunarþættir.
3. Gagnkvæm umbreyting milli fjölpeptíðhluta:
Eftir vinnslu eru GIP og GLP-1 peptíðin sameinuð aftur til að mynda GLP-1 fjölpeptíðið. Þetta ferli krefst notkunar á glúkagonlíku peptíði 1 (GLP-1) sem sniðmát sem önnur einstök peptíð eru sameinuð við til að mynda ný samsett fjölpeptíð. Þetta ferli krefst einnig ákveðinna ensíma og þátta, þar á meðal Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) og Carboxypeptidase E (CPE).
4. GLP-1 seyting:
Eftir að GLP-1 hefur verið myndað og unnið er það geymt í umfrymi og innri blöðrum innkirtlafrumna. Þegar þær eru örvaðar með mataræði losa innkirtlafrumur GLP-1 og komast inn í blóðrásina í gegnum öræðar. Þetta ferli er stjórnað og stjórnað í gegnum röð merkjaflutningsleiða, þar á meðal cAMP-Ca2 plúsog svo framvegis.
Í stuttu máli, lífmyndun GLP-1 felur í sér sameiginlega aðgerð margra tengla og þátta. Samsetning líf- og efnamyndunar getur veitt betri grunn og stuðning við rannsóknir og framleiðslu á GLP-1.
Aðferð fimm, ensím nýmyndun:
Ensímmyndun er nýmyndun peptíðkeðja með hvata líffræðilegra ensíma. Í samanburði við hefðbundnar vökvafasa nýmyndunaraðferðir er hægt að framkvæma ensímmyndun við stofuhita og velja mikið úrval af hráefnum. Ensím eins og theta-fljótandi synthasi, AEP, ACE, osfrv. eru venjulega notuð til að hvetja myndunina.
Að lokum eru ofangreindar aðferðir framkvæmanlegar aðferðir við GLP-1 myndun. Mismunandi aðferðir henta fyrir mismunandi tilraunaaðstæður og lyfjaframleiðsluumhverfi.